近日，中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院賴(lài)良學(xué)課題組在Genome Biology（《基因組生物學(xué)》）發(fā)表了題為“Doxycycline-dependent Cas9-expressing pig resources for conditional in vivo gene nullification and activation”的研究論文，該研究構建了可通過(guò)小分子藥物靈活調控基因剪刀蛋白Cas9表達的工具豬，利用該工具模型，實(shí)現了成體大動(dòng)物體內高效基因編輯，并首次構建了大動(dòng)物原發(fā)性可轉移的胰腺導管腺癌模型。

　　豬不僅是重要的農業(yè)經(jīng)濟動(dòng)物，也是重要的醫學(xué)動(dòng)物模型。隨著(zhù)基因編輯技術(shù)的發(fā)展，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的出現，越來(lái)越多具有重要應用價(jià)值的基因修飾豬模型被培育出來(lái)。構建這些模型主要通過(guò)受精卵注射或體細胞核移植技術(shù)來(lái)實(shí)現。然而，通過(guò)受精卵注射方式獲得的基因編輯動(dòng)物往往是嵌合體，需通過(guò)進(jìn)一步的繁殖才能獲得目標基因型，通過(guò)體細胞核移植方式獲得基因編輯動(dòng)物涉及復雜、低效的體細胞克隆過(guò)程，耗時(shí)、耗力且成本極高。

　　為了解決以上問(wèn)題，賴(lài)良學(xué)課題組多年來(lái)一直致力于培育嵌入基因剪刀（Cas9蛋白）的工具豬模型，早在2017年，培育出了以Cre重組酶為開(kāi)關(guān)來(lái)啟動(dòng)Cas9蛋白表達的工具豬，首次實(shí)現了對成體大動(dòng)物直接進(jìn)行體內基因編輯，并將其成功地用于原發(fā)性肺癌模型的建立（Genome Research, 2017）。但該工具豬模型的應用需要在體內遞送入Cre重組酶，其過(guò)程復雜、昂貴，且效率較低。另外，Cre重組酶對Cas9蛋白表達的啟動(dòng)是永久性的，而Cas9蛋白在體內的持續表達，會(huì )引起基因組損傷、脫靶效應及免疫反應等不利影響。

　　四環(huán)素誘導基因表達系統可通過(guò)簡(jiǎn)單的小分子藥物Dox靈活地調控外源基因的表達時(shí)間與表達量，且具有簡(jiǎn)單、高效及易操作的特點(diǎn)。2022年，賴(lài)良學(xué)課題組通過(guò)基因編輯技術(shù)將該調控系統引入豬體內，培育出了Dox誘導外源基因表達工具豬模型，并證明了其對任意外源基因的可調控表達的有效性（Science China Life Sciences, 2022）。在本次研究成果中，研究人員進(jìn)一步將Dox誘導外源基因表達系統和Cas9蛋白一起嵌入豬體內，培育出了帶有升級版基因剪刀的工具豬。

　　研究人員首先證實(shí)，小分子藥物可對工具豬體內的Cas9蛋白表達時(shí)間和表達劑量加以靈活調控，即Cas9表達由藥物施用與撤除而加以啟動(dòng)和關(guān)閉，而表達量受給藥劑量控制。另外，通過(guò)對懷孕母豬進(jìn)行藥物處理，小分子藥物Dox可跨過(guò)胎盤(pán)屏障，實(shí)現胎兒體內剪刀蛋白Cas9的高效誘導表達。接著(zhù)，研究人員進(jìn)一步證實(shí)，誘導表達的剪刀蛋白Cas9不僅可以切割基因組，導致基因失活及染色體重排，還可以采用截短失活型sgRNA及轉錄激活蛋白組合，實(shí)現內源靶標基因的表達激活。

　　為了驗證利用該工具模型進(jìn)行體內基因編輯的效果，研究人員將包裝有靶向兩個(gè)抑癌基因（TP53、LKB1）的sgRNAs和人KRASG12D表達框的腺相關(guān)病毒通過(guò)胰腺導管和/或直接胰體注射至胰腺內，誘導產(chǎn)生致癌基因突變。21周后，豬出現明顯的腹脹和攝食減少，PET-CT結果顯示腹腔內出現明顯的代謝信號異常，解剖結果顯示，胰腺內出現大量腫瘤，并且已轉移至肝臟、腸及膈膜等器官/組織，組織切片結果也顯示出現了典型的胰腺導管腺癌病理變化。

　　研究團隊獲得的Dox誘導Cas9表達豬模型，將為直接進(jìn)行體內基因編輯、體內基因文庫篩選及體內基因表達調控提供理想的工具。

　　另外，研究人員還在該工具基礎上，通過(guò)時(shí)空調控Cas9表達，建立了一步體細胞克隆法即可獲得能夠穩定遺傳的時(shí)空特異性單或多基因敲除豬模型的策略，為后續構建各種用途的新型條件性基因敲除豬模型提供了極大便利，也為細胞譜系示蹤模型構建、基因治療過(guò)程中Cas9蛋白的安全性評估等研究提供理想的工具。

　　本研究中，中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院賴(lài)良學(xué)課題組金琴副研究員、劉曉藝博士研究生、莊鎮鵬博士研究生以及廣東省實(shí)驗動(dòng)物監測所黃家園博士為共同第一作者，賴(lài)良學(xué)研究員和王可品研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、海南省重大科技計劃、中國科學(xué)院青年創(chuàng )新促進(jìn)會(huì )和中國科協(xié)青年人才托舉工程等項目的資助。

　　論文鏈接

　　Dox誘導Cas9表達工具豬模型培育與應用

　　（A）Dox誘導Cas9蛋白表達原理圖；（B）原代Dox誘導Cas9表達工具豬照片；（C）基于Dox誘導Cas9表達工具豬構建原發(fā)性胰腺導管腺癌模型示意圖；（D）原發(fā)性胰腺導管腺癌及其轉移器官/組織照片；（E）Dox誘導Cas9表達工具豬的應用領(lǐng)域