單堿基編器是近年才出現的新基因編輯系統,被認為是基因編輯技術(shù)3.0版本。該系統的基本原理是基于脫氨酶的作用,將胞嘧啶(C)轉變?yōu)樾叵汆奏?T)(Cytidine base editors, CBEs),或將腺嘌呤(A)轉變成鳥(niǎo)嘌呤(G)(adenine base editors, ABEs),這種堿基間的相互轉換,不會(huì )引起雙鏈 DNA 的斷裂,利用其進(jìn)行基因編輯,更加有效而又安全。而較早期的Cas9等基因編輯工具均會(huì )伴隨DNA斷裂,后者會(huì )造成基因組的不穩定性,對被編輯的生物機體帶來(lái)安全隱患。

　　單堿基編輯器出現以后,很快被廣泛地運用于動(dòng)物、植物和人細胞的基因編輯。但是,以往的研究主要集中在單位點(diǎn)的堿基突變。而人類(lèi)遺傳性疾病以及動(dòng)物遺傳性狀改變往往涉及到多個(gè)位點(diǎn)的單堿基突變,因此,對基因組的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單堿基編輯才更有可能培育出能夠模擬人遺傳性疾病的大動(dòng)物模型和擁有優(yōu)良遺傳性狀的畜禽新品系。

　　該研究利用BE3和A3A-BE3兩種單堿基編輯工具,在細胞和胚胎層面,對基因組進(jìn)行三基因單堿基編輯,每個(gè)基因設計一條gRNA,突變成終止密碼子或者突變誘導新的mRNA剪切位點(diǎn)。在胎胚上,三基因同時(shí)被編輯效率最高可達50%。而細胞層面,三基因同時(shí)編輯最高可達25%。在很多動(dòng)物體內存在有內源性逆轉錄病毒,這種基因系列相同的內源性病毒往往以多拷貝的形式分布于染色體的不同位點(diǎn)。而豬內源性病毒的存在,給豬作為異種移植器官供體帶來(lái)安全隱患。本研究還對與豬內源性病毒復制有關(guān)的pol基因進(jìn)行了單堿基突變,制造提前的終止密碼子,從而實(shí)現單基因的多位點(diǎn)失活。通過(guò)二代測序分析,可以看到在體細胞內,多拷貝的敲除率達到80%以上,而在胚胎層面,71%病毒拷貝得到敲除。因此,本研究證明,單堿基編輯系統在細胞和胚胎水均可實(shí)現多基因或單基因多位點(diǎn)的高效堿基突變。

　　本研究進(jìn)一步通過(guò)胚胎注射以及體細胞核克隆的途徑分別培育出了單基因突變豬和多基因突變豬。所獲得含有單基因突變的杜氏肌肉營(yíng)養不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)豬模型以及早衰癥(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS)豬模型,均極好地模擬了病人的表型。所獲得的與免疫細胞發(fā)育相關(guān)的三基因(RAG1、RAG2、IL2RG)純合突變豬的胸腺和脾臟發(fā)育有明顯缺陷,T細胞、B細胞及NK細胞缺失,免疫細胞不能進(jìn)行V(D)J基因組重排,具有典型的重癥免疫缺陷表型。由于豬的免疫系統與人非常相似,這種重癥免疫缺陷豬模型將成為生物醫藥研究領(lǐng)域的重要基因修飾工具豬。

　　該論文的共同通訊作者為賴(lài)良學(xué)研究員以及王可品副研究員。廣州生物醫藥與健康研究院博士研究生謝精科、葛維凱、栗楠、劉琪帥為共同第一作者。研究工作得到中國科學(xué)院戰略先導專(zhuān)項、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、廣東省實(shí)驗室、廣東省及廣州市科技計劃、中國科學(xué)院青年創(chuàng )新促進(jìn)會(huì )等項目的支持。