iPS克隆豬

美國培育出的轉基因豬

豬對人類(lèi)做出的貢獻的確巨大

　　誕生于1996年7月5日的“克隆羊”多莉，曾被美國《科學(xué)》雜志評為“1997年世界十大科技進(jìn)步”的第一項，也是當年最引人矚目的國際新聞之一?？茖W(xué)家認為，“多莉”的誕生標志著(zhù)生物技術(shù)新時(shí)代的來(lái)臨。最近幾年基因編輯技術(shù)發(fā)展突飛猛進(jìn)。如今，科學(xué)家已開(kāi)始利用基因編輯技術(shù)改造豬的器官，結合克隆動(dòng)物技術(shù)培育能夠為人類(lèi)捐獻器官的豬，用以治療一些晚期器官功能衰竭疾病。 

　　科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已在逐漸克服各種異種器官移植的難題。如果有一天，你的器官已經(jīng)衰竭，無(wú)法再支持你的生命，你不必苦苦等待那1%的器官移植機會(huì )，為你量身打造（基因編輯）的豬器官將為你帶來(lái)新生。 

　　1、豬是人類(lèi)器官 最理想的供體對象　

　　自20世紀80年代免疫抑制藥物應用以來(lái)，臨床器官移植就成為晚期器官功能衰竭的首選治療手段。但器官來(lái)源在全世界范圍內一直存在嚴重短缺的問(wèn)題，人們便想到可以從動(dòng)物身上來(lái)尋找相關(guān)器官來(lái)源。無(wú)論從倫理學(xué)、繁殖特性、傳染病風(fēng)險、器官大小和生理學(xué)等多方面考慮，豬都是人類(lèi)器官最理想的供體對象。 

　　只是，豬器官植入人體，存在的一個(gè)最大障礙是超急性排斥反應。因此，避免該反應便是異種器官移植的關(guān)鍵。 

　　非靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物的細胞表面有一種被稱(chēng)為是α-1,3半乳糖（即α-Gal）的抗原，在長(cháng)期的生命進(jìn)化中，α-Gal在靈長(cháng)類(lèi)包括人體中已經(jīng)消失，但卻有針對該抗原決定簇的天然抗體。所以，如果將其它動(dòng)物的器官和組織移植入靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物，其內在抗體與外來(lái)組織器官細胞表面的α-Gal相結合，會(huì )引發(fā)補體系統的鏈式激活，能夠在幾十分鐘到數小時(shí)之內將外來(lái)的移植物殺死。這就產(chǎn)生了“超急性排斥反應”。 

　　最初，人們試圖通過(guò)一般的轉基因技術(shù)，生產(chǎn)能降低或掩蓋半乳糖基轉移酶活性的轉基因豬，但效果不明顯。只有培育出完全不含α-Gal的轉基因豬，才能徹底消除這種排斥反應。自從2002年，賴(lài)良學(xué)所在的美國研究團隊克服了體細胞基因打靶技術(shù)和體細胞核移植技術(shù)兩大技術(shù)障礙，成功獲得世界首例“半乳糖基轉移酶基因敲除的克隆豬”，美國哈佛大學(xué)醫學(xué)院又利用該“半乳糖苷轉移酶雙基因敲除克隆豬”的器官，移植到狒狒體內。腎臟移植后狒狒存活了83天，另一只心臟移植后的狒狒存活長(cháng)達6個(gè)月（該結果先后發(fā)表于《Nature Medicine》上）。隨后十幾年里，科學(xué)家們在“半乳糖苷轉移酶雙基因敲除豬”的基礎上，對豬開(kāi)展了多基因修飾，以降低人體對豬器官的免疫排斥，豬器官在非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物體內的存活時(shí)間也越來(lái)越長(cháng)。 

　　今年4月，《Nature Communications》發(fā)表了美國國家衛生研究院異種豬心臟移植的突破性進(jìn)展。該研究小組在“半乳糖苷轉移酶基因敲除純合子豬”的基礎上，又獲得了一種“三基因修飾轉基因豬”?？茖W(xué)家將該轉基因豬的心臟移植到狒狒體內，輔助抗體藥物治療，最終使異種豬心臟在狒狒體內平均存活298天，其中一只活了945天，創(chuàng )造了異種器官移植的新紀錄。 

　　在異種移植領(lǐng)域有一個(gè)共識是，如果豬器官在狒狒身上能夠存活一年，就可以開(kāi)展豬器官的人體移植實(shí)驗。因此，豬心臟移植入人體的臨床實(shí)驗指日可待。 

　　2、異種胰島移植或最先應用臨床　

　　早在上世紀20年代，醫學(xué)界就發(fā)現了胰島素的功能。一開(kāi)始，科學(xué)家在狗的身上發(fā)現了胰島素和能夠產(chǎn)生胰島素的胰島，就覺(jué)得它非常有趣——平時(shí)不活躍，但一旦周?chē)h(huán)境中葡萄糖濃度提升，胰島就會(huì )分泌胰島素來(lái)調控身體各個(gè)器官和組織代謝、分解葡萄糖。有了這一理論的支撐，生物醫藥界、化學(xué)界一直在為糖尿病患者尋找最合適的胰島素來(lái)源。 

　　胰島隱藏在胰腺內，體積微小僅150-400微米大小。人類(lèi)的胰腺含有75萬(wàn)-200萬(wàn)個(gè)胰島，經(jīng)過(guò)提純后一般只能保留20萬(wàn)- 50萬(wàn)個(gè)胰島。 

　　上世紀50年代，英國科學(xué)家最早測定了牛胰島素的全部氨基酸序列，開(kāi)辟了人類(lèi)認識蛋白質(zhì)分子化學(xué)結構的道路。1965年9月17日，中國科學(xué)家人工合成了具有全部生物活力的結晶牛胰島素，它是第一個(gè)在實(shí)驗室中用人工方法合成的蛋白質(zhì)。但牛的胰島素與人類(lèi)自身胰島素存在著(zhù)三個(gè)氨基酸的差異，因此效價(jià)較低，用于治療時(shí)需要更大的劑量，且更容易產(chǎn)生藥物依賴(lài)(胰島素越打越多)。 

　　進(jìn)入21世紀，生物醫學(xué)技術(shù)，已經(jīng)能夠直接產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)人胰島素。但即便是產(chǎn)生出了足夠劑量的胰島素，依然存在著(zhù)諸多問(wèn)題。比如使用短效胰島素，吃了飯就要打一針；長(cháng)效胰島素，需要一天打兩針，等等。而且患者患病越久，使用的劑量往往越大。所以，從捐獻者處獲得人類(lèi)胰島進(jìn)行移植，早在1977年就開(kāi)始嘗試了。截至2012年，全世界一共有1400人接受了人胰島同種異體移植，但移植成功率也就只有58%的水平。胰島移植本身在技術(shù)上沒(méi)有什么難度，與其他器官移植如肝移植、腎移植相比，胰島移植屬于細胞移植，移植風(fēng)險也相對微小。只是胰島器官來(lái)源非常有限。 

　　來(lái)源于人類(lèi)的胰島捐獻太過(guò)稀少，醫學(xué)界就將目光投向了其它動(dòng)物。比如同為哺乳動(dòng)物的豬、牛等。它們與人類(lèi)在基因層面的相似度非常高，超過(guò)80%。具體到胰島、胰島素層面，差異就更加小。來(lái)自中國、新西蘭的醫生一直在進(jìn)行動(dòng)物源性的胰島移植研究。比如中南大學(xué)湘雅附三院的王維課題組對22例施行“豬-人”胰島移植的糖尿病患者進(jìn)行復查，結果顯示：手術(shù)后20例患者的胰島素使用量減少了30%以上，屬“有效”；其中6例減少了50 %以上，達“顯著(zhù)療效”，其中1人脫離胰島素達一周之久，為“暫時(shí)治愈”。這一研究的關(guān)鍵在于，直接移植豬的胰島，生物安全性問(wèn)題并沒(méi)出現。用了豬胰島的患者，也并沒(méi)有因此更容易得豬流感或更容易感染豬鏈球菌。只是這種治療糖尿病的效果仍不如人胰島移植，畢竟兩者存在一個(gè)氨基酸的差異。 

　　近日，湘雅醫院有關(guān)團隊又將誘導免疫耐受新技術(shù)應用到了豬胰島異種治療糖尿病，達到了非常接近人同種異體胰島移植臨床療效。該研究獲得的“純合子人源化胰島素基因修飾豬”，將為糖尿病的治療提供人胰島素，同時(shí)也將為臨床異種胰島移植治療提供更為理想的供體來(lái)源。目前，賴(lài)良學(xué)研究團隊也正通過(guò)克隆技術(shù)和正常的動(dòng)物繁育技術(shù)加快該“人源化胰島素基因修飾豬”的繁殖，嘗試通過(guò)修改豬胰島素編碼基因，使其直接編碼生產(chǎn)出人胰島素，期望在2-3年內進(jìn)行非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物的豬胰島移植試驗后正式進(jìn)行臨床試驗。 

　　3、“基因修飾豬”后代都是“親人豬”　

　　日前，中科院廣州生物醫藥和健康研究院賴(lài)良學(xué)課題組，在對小豬特定基因進(jìn)行精準的修飾后，讓該小豬和其子代、孫代出生的小豬都變成了這種能分泌人類(lèi)胰島素的“親人豬”。 

　　在對30-35天的小豬胎兒進(jìn)行處理后，研究人員可先期得到小豬的成纖維細胞。對獲得的小豬成纖維細胞特定基因進(jìn)行精準的修飾后，通過(guò)克隆技術(shù)，用基因編輯后的成纖維細胞替換豬卵子的細胞核，由此就能生成的新的豬克隆胚胎細胞，然后再植入到母豬的輸卵管中。剩下的懷孕、分娩工作，就由小豬的母親自己完成。 

　　要滿(mǎn)足醫學(xué)臨床試驗用途，還需要擴大繁殖這一種類(lèi)的豬群。畢竟一個(gè)I型糖尿病患者進(jìn)行的胰島移植，可能需要20頭左右的小豬來(lái)提供。只有擴大繁殖后，無(wú)論是用這些豬來(lái)生產(chǎn)人胰島素也好，還是只提純豬的胰島用來(lái)進(jìn)行胰島移植手術(shù)也好，都會(huì )更加便利。 

　　這一技術(shù)還在后續研究中，下一步，研究人員希望能夠在猴子這一靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物身上進(jìn)行基因編輯豬胰島的移植試驗。然后有望在5年內進(jìn)入臨床試驗，隨后進(jìn)入臨床應用。目前該課題組的相關(guān)研究已在線(xiàn)發(fā)表在國際知名的《分子細胞生物學(xué)雜志》上。 

　　其實(shí)現代醫學(xué)發(fā)現，人類(lèi)所有的遺傳性疾病中，大多數疾病屬于明確的基因點(diǎn)突變疾病。在明確了發(fā)病原理后，科學(xué)家們已經(jīng)能通過(guò)豬等其他生物來(lái)模擬人類(lèi)的疾病了。通過(guò)基因編輯技術(shù)，甚至可以讓豬也患上地中海貧血、帕金森、衰老等疾病，然后利用這些患“人病”的豬替人試藥，最終選出有效的治療藥物和治療策略，反過(guò)來(lái)治人病。這就是“模式生物”在為現代醫學(xué)界選藥過(guò)程中發(fā)揮的巨大作用。 

　?。ū疚膩?lái)源：中科院廣州生物醫藥與健康研究院） 

　　漸凍人癥相關(guān)的研究——漸凍豬　

　　早前流行一時(shí)的“冰桶挑戰活動(dòng)”，就是為呼吁全世界關(guān)注“漸凍人”而發(fā)起的。肌萎縮側索硬化癥，俗名就是“漸凍人癥”，是一種無(wú)法治愈而且致命的神經(jīng)退行性疾病?；颊咴谂R床上表現為上、下運動(dòng)神經(jīng)元混合受損，導致球部、四肢、軀干、胸部和腹部的肌肉僵直、顫搐并逐漸萎縮，最終患者因吞咽和呼吸困難而死亡。 

　　目前已知的漸凍人癥的致病基因主要為SOD1、TDP-43、FUS等。然而，轉基因小鼠模型的研究一直難以模擬病人這一典型的病理變化。中科院廣州生物醫藥與健康研究院賴(lài)良學(xué)課題組與中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李曉江研究組，利用體細胞核移植的方法，曾成功地建立“轉基因亨延頓舞蹈癥豬”和“轉入突變SOD1基因的漸凍人癥豬”模型。 

　　后來(lái)，他們合作建立了“轉基因TDP-43西藏小型豬”模型。該轉基因豬表現出“漸凍人”的癥狀，同時(shí)存在類(lèi)似人類(lèi)疾病患者中神經(jīng)細胞質(zhì)TDP-43聚集的現象。此研究不僅揭示了TDP-43的新型致病機理，也提示大動(dòng)物模型更能表現出與病人病理變化較為接近的特征。 

　　相關(guān)人體實(shí)驗仍未獲批準　

　　華爾街時(shí)報最新消息稱(chēng)，在美國，已有超過(guò)12萬(wàn)人在等待著(zhù)器官移植，卻沒(méi)有足夠的捐獻者。這種嚴重的短缺讓研究人員將一個(gè)不尋常的解決方案提上日程：用轉基因豬提供器官用于人體移植。 

　　其實(shí)這項異種移植的研究已進(jìn)行了幾十年。去年美國哈佛大學(xué)一組科研人員發(fā)表論文稱(chēng)，他們使用一種新的基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9，已能基本敲除豬基因中的病毒殘余物質(zhì)。因此，如今甚至有消息稱(chēng)，美國有可能明年就會(huì )開(kāi)始在人體上進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗。 

　　但國際異種移植協(xié)會(huì )今年更新了聲明，說(shuō)在進(jìn)行人體臨床實(shí)驗之前，已獲得改良的轉基因豬的胰島的異種動(dòng)物，至少需要存活六個(gè)月或更長(cháng)的時(shí)間。他們當然希望第一名參與實(shí)驗的病人就能獲益，但畢竟我們還不知道豬基因里是否還攜帶某些未知病毒，可能對豬無(wú)害，或者對其它動(dòng)物也無(wú)害，卻可能會(huì )感染人類(lèi)。目前美國食品和藥物管理局對啟動(dòng)人體臨床試驗這一申請的態(tài)度仍是保守的：這種異種移植最多只能限于那些患有某些疾病嚴重至危及生命的人，前提還應該是其他治療方式已不足以對其進(jìn)行醫治。 

　　不過(guò)參與相關(guān)研究的Tector博士說(shuō)，對于一些年紀較大的患者來(lái)說(shuō)，可能在去世前都等不到一個(gè)相匹配的可供移植的器官，那么嘗試移植一個(gè)轉基因豬的器官也未嘗不是一件好事。（那拉）　　 

　　第一頭克隆豬的誕生　

　　鏈接 

　　由于豬的生理特征、組織細胞結構和人類(lèi)十分類(lèi)似，因此豬等大動(dòng)物的基因修改、誘導多能性干細胞（iPS）等研究受到世界各國科學(xué)家的重視。 

　　2002年，賴(lài)良學(xué)所在的美國研究團隊成功獲得世界首例“半乳糖基轉移酶基因敲除的克隆豬”。這是全世界第一頭“基因敲除豬”（或稱(chēng)“基因打靶豬”）。2011年，任職于中科院廣州生物醫藥與健康研究院的賴(lài)良學(xué)博士、浙江大學(xué)肖磊博士和華大基因研究所杜玉濤博士等的共同努力下，賴(lài)良學(xué)課題組又率先獲得了全世界第一頭的成活的“iPS克隆豬”。 

　　獲得基因打靶的iPS細胞之后，一方面可以通過(guò)嵌合體技術(shù)，獲得生殖系嵌合的動(dòng)物，再經(jīng)過(guò)交配獲得“基因修飾動(dòng)物”；另一方面，可將這些基因打靶iPS細胞為核供體，通過(guò)核移植技術(shù)獲得“基因修飾克隆動(dòng)物”。賴(lài)良學(xué)通過(guò)長(cháng)期開(kāi)展人和動(dòng)物胚胎干細胞的分離培養、轉基因動(dòng)物的建立、動(dòng)物克隆及人類(lèi)治療性克隆等研究，已發(fā)表相關(guān)論文100余篇，并成功地建立了30余種在生物醫藥和農業(yè)領(lǐng)域具有重要用途轉基因豬?！趵钚∑?nbsp;

　　原載于《羊城晚報》（2016年12月03日 B4版 晚會(huì )）