在中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院賴(lài)良學(xué)課題組用于研究的養豬場(chǎng)里，生活著(zhù)一群特別的豬。這里不僅有十幾頭帶有基因剪刀的工具豬，而且擁有六七百頭其他在生物醫藥領(lǐng)域具有重要應用價(jià)值的基因修飾豬。而這些豬的用途聽(tīng)起來(lái)更加“駭人”，有些基因修飾豬可以模擬人類(lèi)疾病，如老年癡呆癥、漸凍人癥和亨廷頓舞蹈癥等，有些豬可為人體器官移植提供異種器官來(lái)源。

　　異種器官移植一直是國際研究的重點(diǎn)方向之一。如果這一重大難關(guān)能夠攻克，將會(huì )為全世界需要器官移植的上百萬(wàn)病人帶來(lái)希望。

　　令人興奮的是，這道通往希望的大門(mén)正在悄然打開(kāi)——不久前，賴(lài)良學(xué)課題組在國際權威雜志《基因組研究》上發(fā)表了一篇關(guān)于構建了條件性表達Cas9基因新型工具豬模型的論文。

　　為何選擇豬 

　　要了解這項研究，先得從Cas9基因說(shuō)起。

　　Cas9基因與CRISPR技術(shù)曾經(jīng)在寨卡病毒暴發(fā)時(shí)大顯身手，被用于監測寨卡病毒，甚至還能用來(lái)檢測SARS、SARS冠狀病毒、麻疹病毒、流感病毒、丙肝病毒等。前者是基因中的一種核酸酶，后者則是“規律成簇間隔短回文重復”的英文縮寫(xiě)，來(lái)自細菌體內，肩負著(zhù)細菌免疫的“重任”。

　　在CRISPR利用病毒DNA自行轉化后驅逐這種病毒的過(guò)程中，Cas9是關(guān)鍵的核酸酶。不過(guò)這次，兩者聯(lián)手卻不是要檢測病毒，而是被研究人員在豬身上“埋入”一個(gè)可以世代遺傳的“秘密”，讓它肩負起更大的使命。

　　這個(gè)秘密就是研究人員通過(guò)定點(diǎn)修改豬的基因組，為實(shí)驗打開(kāi)“方便之門(mén)”。

　　一直以來(lái)，醫學(xué)技術(shù)的進(jìn)步離不開(kāi)實(shí)驗動(dòng)物的犧牲。這是因為要獲得有關(guān)生物學(xué)、醫學(xué)等方面的新知識或解決具體問(wèn)題，人類(lèi)無(wú)法在自身上實(shí)驗，只能在實(shí)驗室使用動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)研究。

　　在用于實(shí)驗的動(dòng)物中，既有小鼠、大鼠、兔子等小動(dòng)物，也有豬、猩猩、狒狒等大動(dòng)物。不過(guò)，因為大動(dòng)物的孕育期、生長(cháng)期和性成熟期較長(cháng)，不如小鼠、大鼠、兔子等小動(dòng)物繁殖時(shí)間短?！叭绻龌驅?shí)驗，就需要在胚胎期間更改基因，再放入代孕母體內，等待降生?！辟?lài)良學(xué)告訴《中國科學(xué)報》記者，“小鼠的孕期是21天，4周可性成熟，繼續繁殖下一代。但豬的孕期就有114天左右，性成熟期則需要6~8個(gè)月?！彼匝芯咳藛T往往會(huì )選擇孕育期較短的小型動(dòng)物，以便早日看到實(shí)驗結果。

　　只是，使用小型動(dòng)物雖然縮短了時(shí)間，卻因為小型動(dòng)物與人體的差別較大，所以實(shí)驗結果往往無(wú)法直接用在人身上。那么誰(shuí)可以肩負重任，與人類(lèi)相近，讓實(shí)驗更接近于真實(shí)呢？

　　在眾多哺乳動(dòng)物中，豬雖然與人的血緣不近，但其器官大小、形態(tài)結構、生理代謝和免疫系統等與人類(lèi)非常接近；再者，豬是人類(lèi)飼養的家畜，數量比狒狒、猩猩等靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物更多，沒(méi)有倫理方面的障礙，所以豬是目前比較理想的實(shí)驗動(dòng)物。

　　但問(wèn)題是，如果想根據實(shí)驗目的敲掉其中特定基因，研究人員又必須從動(dòng)物胚胎期開(kāi)始實(shí)施，待到動(dòng)物被孕育出來(lái)才能進(jìn)行實(shí)驗。這樣不僅延長(cháng)了實(shí)驗時(shí)間，而且因為培育過(guò)程復雜，成功率比較低，導致開(kāi)銷(xiāo)很大。

　　從事基因修飾克隆豬研究近20年的賴(lài)良學(xué)，意識到如果培育一種能夠在體內直接進(jìn)行基因編輯的工具豬就可以解決上述問(wèn)題。

　　中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院博士、論文第一作者王可品在接受《中國科學(xué)報》記者采訪(fǎng)時(shí)解釋說(shuō)：“我們設想可以通過(guò)基因編輯技術(shù)，將能夠切割基因組的蛋白基因加入到豬的基因組，這樣就等于在豬的體內插入了一把基因剪刀?！倍?，通過(guò)體細胞克隆獲得這種帶有基因剪刀的第一代工具豬，還能通過(guò)簡(jiǎn)單的配種實(shí)現世代遺傳，形成帶有基因剪刀的豬種群。這樣實(shí)驗人員就可直接在成年豬身上做實(shí)驗，而不必再從胚胎期做起，從而簡(jiǎn)化并大大地加快實(shí)驗流程。

　　　四年的堅守 

　　找到了研究方向后，2013年，賴(lài)良學(xué)又帶領(lǐng)團隊巧妙地設計了實(shí)驗方案，接下來(lái)的任務(wù)，便是向著(zhù)目標不斷前行。

　　在實(shí)驗過(guò)程中，研究人員利用基因打靶技術(shù)，將能夠剪開(kāi)基因的Cas9蛋白基因插入到豬基因組的特定位點(diǎn)ROSA26?！癈as9蛋白作為剪刀，預先埋入豬基因中。不過(guò)為了防止Cas9亂剪，所以又加入了開(kāi)關(guān)?！辟?lài)良學(xué)解釋說(shuō)。

　　控制這一開(kāi)關(guān)的關(guān)鍵是Cre重組酶。Cre（Cyclization Recombination Enzyme，即環(huán)化重組酶）是來(lái)源于噬菌體P1的一種酶蛋白，它可以識別催化基因中兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間發(fā)生同源重組，從而造成DNA的缺失、易位等現象。這一特性在基因工程操作中得到廣泛的應用，尤其在誘導型基因剔除小鼠的建立中應用得十分成功。

　　那么，將這一技術(shù)應用到豬身上能否獲得成功呢？“我們做得很順利，因為我們當時(shí)實(shí)驗設計得比較好，所以第一代豬孕育出來(lái)時(shí)就得到了想要的結果?！辟?lài)良學(xué)回憶說(shuō)。

　　其實(shí)，實(shí)驗之所以如此順利，也得益于賴(lài)良學(xué)多年的“修煉”。他自2007年回國之后，一直從事基因修飾豬模型的構建，在這以前在多種基因修飾豬方面都取得了重大突破，良好的基礎保證了此工具豬實(shí)驗的順利進(jìn)行。

　　王可品是賴(lài)良學(xué)課題組一名碩博連讀的研究生，他還清晰地記得，2015年4月份的一天，克隆的工具豬誕生?！靶∝i生出來(lái)是下午兩三點(diǎn)，我們需要通過(guò)分子實(shí)驗來(lái)驗證小豬是否是我們需要的工具豬?！睘榱吮M快得到實(shí)驗結果，王可品與其他研究人員一起在實(shí)驗室中進(jìn)行鑒定。

　　那一夜注定無(wú)眠。王可品和同事從下午一直忙碌到第二天清晨九點(diǎn)，當實(shí)驗結果顯示為陽(yáng)性時(shí)，他們特別興奮——他們成功了！

　　不論是第一代，還是由之繁殖起來(lái)的后代工具豬，外表和其他功能與正常家豬并無(wú)不同?！八鼈儾粫?huì )出現特異性疾病?！辟?lài)良學(xué)說(shuō)。

　　關(guān)鍵是，在配種時(shí)，如果公豬與母豬只有一方進(jìn)行了基因修飾，那么后代并非所有都會(huì )呈現陽(yáng)性；如果公豬與母豬雙方都完成了基因修飾，那么所孕育的全部后代會(huì )100%繼承這一基因。

　　這意味著(zhù)，實(shí)驗人員在使用工具豬進(jìn)行實(shí)驗時(shí)，不需要每次都對豬的基因組進(jìn)行修飾，只需要在第一代即F0代豬的基因組特定位點(diǎn)插入Cas9蛋白基因，就可以依靠豬的自然繁殖得到同等類(lèi)型的“天生自帶基因剪刀”的豬，即工具豬。

　　這只是開(kāi)始 

　　在等待工具豬的繁育結果過(guò)程中，賴(lài)良學(xué)還將這一技術(shù)用在狗身上。2015年，賴(lài)良學(xué)帶領(lǐng)另一隊研究人員，在狗的胚胎期使用了同樣的方法，即敲掉了其中的一部分基因。這讓被孕育出的小狗呈現出肌肉更發(fā)達、運動(dòng)能力更強的特點(diǎn)。

　　因為狗在營(yíng)養代謝、生理解剖、心血管系統等方面與人類(lèi)極其相似，且狗較為聰明，所以會(huì )被用來(lái)進(jìn)行行為學(xué)研究，適合建立帕金森氏綜合征、老年癡呆等狗模型來(lái)研究人類(lèi)疾病。當然，狗作為寵物，通過(guò)基因敲除來(lái)研究培育還可以用來(lái)優(yōu)良遺傳性狀。

　　在工具豬繁育出后代以后，賴(lài)良學(xué)團隊的研究人員又圍繞其潛在的應用價(jià)值展開(kāi)了研究。他們首先想到的是利用基因剪刀工具豬制備原發(fā)性癌癥模型。

　　以前制備用于腫瘤發(fā)病機制研究和藥物研發(fā)的腫瘤模型大多是將人的腫瘤細胞移植到裸鼠體內來(lái)實(shí)現的?！奥闶笫窃谂咛テ谕耆玫羲信c免疫力相關(guān)的基因誕生的鼠類(lèi)，即一出生就不帶任何免疫力?！辟?lài)良學(xué)進(jìn)一步解釋說(shuō)，“以這種方式制備的小鼠腫瘤模型，一方面因為沒(méi)有免疫能力，另一方面，不是原發(fā)性腫瘤，因此與人體腫瘤的發(fā)生發(fā)展有很大的差別，用它對腫瘤藥物進(jìn)行有效性和安全性檢測的結果95%以上不能轉化為臨床應用?！?/p>

　　研究人員將包裝含有Cre重組酶和靶向六種腫瘤相關(guān)基因的gRNAs慢病毒通過(guò)滴鼻方式，感染工具豬的肺臟，即讓豬肺細胞的基因組發(fā)生癌化突變。果然，三個(gè)月后，該工具豬出現了典型的肺癌癥狀和病理變化，從而成功地建立了原發(fā)性肺腫瘤大動(dòng)物模型。

　　“這種工具豬可在癌癥研究中發(fā)揮重要作用，因為癌癥本身就是基因突變?！辟?lài)良學(xué)解釋說(shuō)。也因此，人體身上的其他癌癥也可以通過(guò)類(lèi)似的方式作用在工具豬上被復制出。

　　“以前，一個(gè)大型動(dòng)物的實(shí)驗就需要花費上百萬(wàn)元，現在有了工具豬，不僅縮短了時(shí)間，費用降低到幾萬(wàn)元即可?！辟?lài)良學(xué)表示。

　　　讓異體移植離臨床更近 

　　無(wú)疑，賴(lài)良學(xué)團隊的研究使異種器官移植往前邁入一大步。

　　眾所周知，異種器官移植是國際研究的重點(diǎn)方向之一。2015年，美國哈佛大學(xué)的中美研究人員在美國《科學(xué)》雜志網(wǎng)絡(luò )版上發(fā)表報告說(shuō)，他們利用一種新的基因編輯技術(shù)，剔除了豬基因組中可能有害的病毒基因，從而攻克豬器官用于人體移植的一個(gè)重大難關(guān)，為需要器官移植的病人帶來(lái)希望。

　　這是因為豬基因組中大約有11%的重復元件（PRE-1），這一比例與靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物的重復元件副本幾乎相同。有研究人員在《自然》雜志上發(fā)表的研究報告稱(chēng)，這些豬重復元件的結構和功能非常類(lèi)似于靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物的重復元件副本，暗示人類(lèi)和豬之間存在比之前所認為的關(guān)系親近得多。

　　現在，賴(lài)良學(xué)利用CRISPR/Cas9技術(shù)，對豬的基因進(jìn)行改造，獲得了多種免疫源性與人體更為接近的基因修飾豬，大大降低了人體異種器官的排斥反應，讓異體移植距離臨床越來(lái)越近。

　　另外，他們也在探索利用基因編輯豬和多能性干細胞技術(shù)培育人體器官的可能性，“比如，胰臟的發(fā)育由一個(gè)關(guān)鍵基因控制，即PDX1基因，所以我們只需敲掉這個(gè)基因就可以讓豬不生長(cháng)自己的胰臟。再在胚胎期，將人全能性干細胞注射到早期發(fā)育的胚胎，理論上，生出來(lái)的豬的胰臟就全部來(lái)自于人的細胞，那么豬長(cháng)大后的胰臟與人的就可以匹配?！辟?lài)良學(xué)舉例說(shuō)。

　　這并非空穴來(lái)風(fēng)，2016年，美國加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校的研究團隊就正試圖透過(guò)向豬的胚胎注入人類(lèi)干細胞，來(lái)培植出可供人體移植的器官，并希望這些“嵌合體”胚胎能為緩解世界移植器官緊缺問(wèn)題提供答案。

　　工具豬、培育人體器官的豬……這些都是賴(lài)良學(xué)團隊的研究?jì)热?，他將CRISPR/Cas9技術(shù)不斷加入自己的理解?！艾F在我的學(xué)生們已經(jīng)青出于藍，他們的討論總是能緊跟世界科技前沿動(dòng)態(tài)?！边@讓賴(lài)良學(xué)更為激動(dòng)。

　　2016年，完成博士論文的王可品選擇留在了賴(lài)良學(xué)的團隊，他希望未來(lái)可以利用大動(dòng)物基因修飾模型為生命科學(xué)和醫學(xué)作出更多貢獻。

?。ㄔd于《中國科學(xué)報》 2017-12-15 第1版 要聞)