近日，中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院與澳門(mén)大學(xué)合作在Cell Reports在線(xiàn)發(fā)表題為Vibrio parahaemolyticus prey targeting requires autoproteolysis-triggered dimerization of the type VI secretion system effector RhsP的研究論文。研究發(fā)現，腸炎弧菌效應蛋白RhsP形成一個(gè)桶狀結構，通過(guò)自水解引發(fā)桶內VIR（VgrG2-interacting region）肽段明顯的構象變化，并進(jìn)一步證明這一構象變化促進(jìn)了RhsP二聚體的形成，釋放核酸酶毒素，提示RhsP以自水解發(fā)生構象變化進(jìn)而促進(jìn)二聚體形成來(lái)靶向獵物細胞這一分子機制，為潛在新型抗感染手段的開(kāi)發(fā)提供了分子機制和理論基礎。

　　細菌Ⅵ型分泌系統（Type VI secretion system, T6SS）廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，其構造類(lèi)似于噬菌體尾管，主要通過(guò)掛載并分泌不同的毒素效應蛋白來(lái)攻擊獵物細胞并取得菌群競爭優(yōu)勢。其中Rhs家族蛋白是一類(lèi)大型效應蛋白,通過(guò)其C端的核酸酶毒素切割獵物細胞DNA以達到殺死獵物的目的。同時(shí)，在毒素效應蛋白基因組的下游通常伴隨可以中和其毒性的免疫因子的表達，這也使得攜帶Rhs毒素的細菌能夠保護自身不受影響。T6SS如何分泌Rhs這樣的大型效應蛋白的分子機制一直是領(lǐng)域內的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，而Rhs家族效應蛋白如何釋放核酸酶毒素這一過(guò)程也未得到明確的解析。

　　本研究首先在致病性腸炎弧菌中發(fā)現了一個(gè)能夠自水解的T6SS效應蛋白RhsP，進(jìn)一步通過(guò)生化實(shí)驗發(fā)現RhsP自水解為三個(gè)片段，N端、 Rhs桶和具有核酸酶毒性的C端（圖1A）。為了解答自水解這一過(guò)程對RhsP的分泌和核酸酶毒素釋放的作用，團隊利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了RhsP自水解后(cleaved RhsP)和RhsP自水解前（Uncleaved RhsP）的高分辨結構(圖1B)。對自水解前后的RhsP的高分辨結構分析后發(fā)現，Rhs區域形成了一個(gè)封閉的桶狀結構。N端肽段從桶蓋頂部縫隙延伸出去，提示N端水解后的離開(kāi)軌跡（圖2A）。另外，發(fā)生水解后的VIR在構象上發(fā)生了巨大變化，它以U形在桶內伸展并將含有核酸酶毒素的VIR-C端送出到桶蓋上移引起的缺口處（圖2B）。最后，通過(guò)結構分析發(fā)現VIR結合β-sheet的疏水內表面，通過(guò)構建VIR-C端F1208A/Y1209A突變株驗證了RhsP自水解后引發(fā)VIR構象變化促進(jìn)二聚體的形成。

　　本研究通過(guò)生化實(shí)驗和冷凍電鏡等手段，捕捉了效應蛋白自水解前后瞬間的構象變化，發(fā)現RhsP的自水解過(guò)程引發(fā)了Rhs桶狀結構的構象變化，揭示了釋放核酸酶毒素的分子機制，同時(shí)也發(fā)現了VIR區域構象變化促進(jìn)的RhsP二聚體形成,是其靶向獵物細胞的關(guān)鍵步驟（圖3）。

　　澳門(mén)大學(xué)博士后唐樂(lè )、中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院博士生董淑琦、澳門(mén)大學(xué)博士后Nadia Rasheed和博士生胡巧穎、生物島實(shí)驗室科研助理周寧坤為本文共同第一作者。澳門(mén)大學(xué)William Chong Hang Chao教授、中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院何俊研究員和澳門(mén)大學(xué)鄭軍教授為本文的共同通訊作者。該研究得到了澳門(mén)大學(xué)、澳門(mén)特別行政區科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金以及國家自然科學(xué)基金、廣東省自然科學(xué)基金等的資助。

論文鏈接

圖1 A: 毒素效應蛋白RhsP結構域示意圖，B: RhsP自水解前后高分辨蛋白結構圖

圖2 A: RhsP自水解前后N端肽段軌跡圖，B: RhsP自水解前后VIR構象變化圖

圖3 RhsP自水解引發(fā)的二聚體形成并靶向獵物細胞的步驟模型