一、什么是慢性粒細胞白血??？ 

　　慢性骨髓性白血?。?/span>chronic myelogenous (or myeloid) leukemia (CML)），又稱(chēng)為慢性粒細胞白血?。?/span>chronic granulocytic leukemia (CGL)），是一種造血干細胞克隆增生性疾病。臨床上根據其癥狀可分為慢性期、加速期和急變期。其特點(diǎn)為由于骨髓干細胞失常而導致的，髓細胞的加速且失控地增長(cháng)，以及髓細胞在血液中的過(guò)度積累。其主要臨床表現為粒細胞（嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞）及其前體過(guò)量。 

　　慢性粒細胞白血病在所有年齡階段都有發(fā)生，但在20～50歲人群中發(fā)病率較高。其年發(fā)病率為0.1~0.2%，男性發(fā)病率略高于女性，占成年白血病患者的15~20%。我國每年新增病例高達30000例。使用傳統治療，病人患病后1~1.5年內由慢性期進(jìn)入加速期，3~6個(gè)月后，進(jìn)入急變期并死亡，另外有20~25%的病人不經(jīng)過(guò)加速期而直接進(jìn)入急變期。病人平均存活時(shí)間為三年，少于20%的病人能存活五年以上。 

　　二、Bcr-Abl癌基因是慢性粒細胞白血病的元兇 

　　慢性粒細胞白血病的發(fā)病機制是9號染色體長(cháng)臂與22號染色體長(cháng)臂的異位。臨床上以費城染色體，即由于染色體異位而異常短小的9號染色體，為特征。由于此種異位，Bcr基因與Abl基因并置在一條染色體上形成Bcr-Abl（Breakpoint cluster region-Abelson leukemia）癌基因，其編碼產(chǎn)生了致癌的Bcr-Abl融合蛋白。這種Bcr-Abl融合蛋白是一種構成性激活的酪氨酸激酶，能導致細胞癌變。而Bcr-Abl激酶也成為了治療慢性粒細胞白血病小分子藥物的主要靶點(diǎn)，通過(guò)抑制其活性，可達到控制及改善慢性粒細胞白血病的目的。 

　　三、人類(lèi)發(fā)明治療慢性粒細胞白血病藥物的過(guò)程 

　　由于只作用于Bcr-Abl相關(guān)蛋白，Bcr-Abl激酶抑制劑以其療效顯著(zhù)，副作用小的優(yōu)點(diǎn)，成為慢性粒細胞性白血病的主要治療手段。目前已有伊馬替尼、尼羅替尼、達沙替尼、博舒替尼和普納替尼等五種Bcr-Abl激酶抑制劑上市。然而，隨著(zhù)臨床應用的增加，部分患者對伊馬替尼產(chǎn)生了耐藥性。伊馬替尼耐藥的產(chǎn)生主要與BCR-Abl激酶的突變有關(guān)，目前已證實(shí)的BCR-Abl突變有15種，包括Y253H、E255V、F359V、T315I等在內，其中T315I在突變中占的比重最大，達20%的耐藥程度，且耐藥程度最高。隨后開(kāi)發(fā)的一系列藥物如博舒替尼、巴菲替尼、塞卡替尼等也都對該突變束手無(wú)策。更糟糕的是，如果患者反復使用達沙替尼和尼羅替尼等二代激酶抑制劑（TKI），T315I突變的比例會(huì )進(jìn)一步增加。因此，開(kāi)發(fā)針對T315I突變有效的TKI已迫在眉睫，為克服耐藥性以及毒副作用問(wèn)題，多種新型Bcr-Abl選擇性抑制劑正在開(kāi)發(fā)中。 

　　本報告所依托的課題就是通過(guò)分析已上市的以及開(kāi)發(fā)中的Bcr-Abl抑制劑的化學(xué)結構及其與蛋白的結合模式，通過(guò)生物電子等排，計算機輔助藥物設計等合理設計方法，設計并合成一系列新型抗T315I突變的Bcr-Abl抑制劑，并與生物學(xué)家和藥理學(xué)家合作，進(jìn)行結構優(yōu)化，構效關(guān)系研究，以及藥理、藥代性質(zhì)等成藥性評價(jià)。 

　　1.已上市的治療CML的小分子靶向藥物 

　　1.1伊馬替尼（Imatinib，Glivec?，STI571） 

　　伊馬替尼（商品名：格列衛，化合物名：STI571）是由瑞士諾華公司研發(fā)的第一個(gè)被批準上市的選擇性酪氨酸激酶小分子抑制劑。伊馬替尼通過(guò)競爭性地抑制ATP與Bcr-Abl激酶的結合，阻止Bcr-Abl激酶磷酸化激活，從而抑制CML癌細胞的增殖，并誘導其凋亡。由于伊馬替尼靶向CML癌細胞特有的Bcr-Abl激酶，療效顯著(zhù)，副作用小。臨床研究表明，伊馬替尼能使95%的慢性期病人，53%的加速期病人以及15%的急變期病人得到完全血液學(xué)緩解。于2001年5月，獲美國FDA加速審批通過(guò)上市。上市后作為治療CML的一線(xiàn)藥物應用于臨床，用藥病人平均5年生存率達88.7%。伊馬替尼的成功證明了采用合理藥物設計，分子靶向的，治療特定疾?。ㄌ貏e是癌癥）的藥物開(kāi)發(fā)策略是切實(shí)可行的。為藥物研發(fā)提高療效，降低副作用指明了方向。 

　　然而，隨著(zhù)伊馬替尼在臨床上的廣泛應用，耐藥性問(wèn)題日益凸顯：部分CML病人對伊馬替尼天然耐受；另一部分病人在用藥一段時(shí)間后，產(chǎn)生獲得性耐藥。在伊馬替尼用藥42個(gè)月后，16%的慢性期病人、大部分加速期和急變期病人產(chǎn)生耐藥而復發(fā)。耐藥的主要原因是Bcr-Abl激酶的突變所導致的ATP口袋形狀及電性的改變阻礙了伊馬替尼的結合。目前已發(fā)現的Bcr-Abl激酶點(diǎn)突變達一百多種，其中T315I突變在突變中占的比重最大。 

　　1.2尼羅替尼（Nilotinib，Tasigna?，AMN107） 

　　尼羅替尼是瑞士諾華公司為克服伊馬替尼耐藥問(wèn)題所開(kāi)發(fā)的第二代酪氨酸激酶抑制劑。于2007年被FDA批準作為CML二線(xiàn)治療藥物上市，用于治療伊馬替尼耐藥或不耐受的費城染色體陽(yáng)性CML。在2010年6月被批準作為一線(xiàn)藥物，用于治療新發(fā)病例。對于野生型Bcr-Abl，尼羅替尼表現出比伊馬替尼強20倍的細胞抑制活性，而且尼羅替尼對于大部分的伊馬替尼耐藥突變型有抑制作用。然而，對主要突變T315I尼羅替尼無(wú)顯著(zhù)抑制作用。  

　　1.3達沙替尼（Dasatinib，Sprycel?，BMS-354825） 

　　達沙替尼是美國百時(shí)美施貴寶公司開(kāi)發(fā)的Src/Abl雙靶點(diǎn)抑制劑。與伊馬替尼和達沙替尼只抑制非活化態(tài)（DFG-out）Bcr-Abl激酶不同，達沙替尼不僅能抑制非活化態(tài)激酶，而且能抑制活化態(tài)（DFG-in）激酶。其對野生型Bcr-Abl激酶的抑制活性是伊馬替尼的325倍和尼羅替尼的16倍，且對除T315I外的大部分突變保持抑制作用。2006年，FDA批準達沙替尼作為二線(xiàn)藥物上市，治療對于伊馬替尼耐藥或不耐受的CML病例。2010年10月，經(jīng)FDA批準成為治療CML的一線(xiàn)藥物。 

　　1.4博舒替尼（Bosutinib，Bosulif?，SKI-606） 

　　博舒替尼是Bcr-Abl/Src/Stat-5抑制劑，2011年由輝瑞公司在歐洲上市，用于治療慢性期CML。在臨床試驗中，用藥24周，有31%的病人獲得主要細胞學(xué)緩解。平均用藥24.2個(gè)月后，86%的病人獲得完全血液學(xué)緩解， 53%的病人獲得主要細胞學(xué)緩解（其中41%獲得完全細胞學(xué)緩解）。用藥兩年，有79%的病人無(wú)病情惡化，92%的病人存活。博舒替尼對大部分的Bcr-Abl突變型有效，但對T315I無(wú)效。2012年，美國FDA批準了該藥的上市，作為二線(xiàn)藥物用于治療其他抑制劑耐藥或不耐受的慢性期、加速期及急變期的費城染色體陽(yáng)性CML。 

　　1.5普納替尼（Ponatinib，Iclusig?，AP24534） 

　　基于良好的ADME性質(zhì)以及臨床試驗數據，普納替尼已作為抗耐藥Bcr-Abl抑制劑，于2012年12月，獲FDA加速審批上市，用于治療耐藥或不耐受的CML和費城染色體陽(yáng)性急性淋巴細胞白血?。?/span>Ph+ ALL）。普納替尼是目前上市藥物中唯一能抑制Bcr-Abl T315I突變型的抑制劑。 

　　2.抗T315I突變類(lèi)的CML治療藥物研究 

　　2.1 什么是T315I突變 

　　“守門(mén)人”殘基蘇氨酸，是在多種酪氨酸激酶中常見(jiàn)的，位于激酶催化域旁的重要殘基。它控制著(zhù)小分子抑制劑進(jìn)入活性口袋的通路。在Bcr-Abl激酶中，315位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，稱(chēng)為T315I（Threonine to Isoleucine at 315 position）突變。 

　　2.2 T315I突變導致耐藥 

　　在使用伊馬替尼治療失敗的CML病人中，有15~20%檢測到了T315I突變。早期研究認為，T315I突變對伊馬替尼耐藥的機制是由于突變后減少了一個(gè)與藥物作用的氫鍵并增大了藥物與伊馬替尼的位阻作用。然而，最新分子動(dòng)態(tài)模擬研究表明，氫鍵個(gè)數的減少并不是T315I伊馬替尼耐藥的主要原因，為適應突變殘基而發(fā)生的蛋白構象調整才是導致伊馬替尼親和力下降的主要因素。 

　　2.3 針對T315I突變的CML治療藥物研究 

　　目前，上市藥物中，只有最新上市的普納替尼能抑制該突變。其它該突變抑制劑尚在開(kāi)發(fā)中（進(jìn)入臨床的抗T315I突變Bcr-Abl抑制劑活性及分類(lèi)見(jiàn)表1-1）。 

　　表1-1.進(jìn)入臨床的抗T315I突變Bcr-Abl抑制劑 

　　3、開(kāi)發(fā)中的CML小分子靶向治療藥物的小分子靶向藥物 

　　雖然尼羅替尼，達沙替尼和博舒替尼成功提高了對野生型Bcr-Abl激酶的抑制活性，并能有效抑制對大部分伊馬替尼耐藥的突變型。然而，對于位于激酶口袋入口的，占所有突變15%~20%的T315I突變卻束手無(wú)策。目前，除剛上市的普納替尼外，沒(méi)有其它上市藥物能夠有效抑制T315I突變型。各大制藥公司競相開(kāi)展了多項藥物研發(fā)工作（大部分針對T315I突變型），下面簡(jiǎn)單介紹已進(jìn)入臨床試驗階段的Bcr-Abl抑制劑。 

　　3.1 PHA-739358 

　　PHA-739358（Danusertib，Jonsson Comprehensive Cancer Center）為吡咯并吡唑類(lèi)化合物，PHA-739358最初由輝瑞公司開(kāi)發(fā)，意圖是作為激酶Aurora A、B和C的抑制劑，治療多發(fā)性骨髓瘤。最新研究表明，PHA-739358能夠抑制野生型Bcr-Abl激酶，并且對T315I突變型的抑制活性達5nM。通過(guò)對其與Bcr-Abl T315I突變型激酶的共結晶研究表明，PHA-739358適應了異亮氨酸至蘇氨酸的突變，結合于活化態(tài)激酶的ATP口袋。2006年，PHA-739358進(jìn)入臨床二期試驗，用于治療包括T315I突變型在內的CML。 

　　3.2VX-680 

　　VX-680（Tozasertib，MK-0457，Merck）是另一個(gè)被發(fā)現有Bcr-Abl激酶活性的Aurora激酶抑制劑，對野生型以及T315I突變型Bcr-Abl的IC₅₀分別為10 nM and 30 nM。蛋白晶體學(xué)研究表明，VX-680亦結合于活化態(tài)Bcr-Abl激酶。2006年，VX-680進(jìn)入臨床I/II期試。但由于其具有引起心臟QTc間期延長(cháng)的副作用，目前已暫停臨床試驗。 

　　3.3 AT9283 

　　AT9283^12b（Astex Pharmaceuticals）能有效抑制T315I突變型Bcr-Abl激酶（IC₅₀< 5nM），同時(shí)也是Aurora A/B、JAK2和JAK3的抑制劑。計算機分子模擬研究表明，AT9283可與活化態(tài)Bcr-Abl T315I突變型激酶結合，競爭性地抑制ATP與激酶的結合，從而抑制其活性。2007年，AT9283進(jìn)入臨床I/II期試驗。2013年，在臨床II期試驗中被FDA推薦終止試驗。 

　　3.4巴菲替尼 

　　巴菲替尼（Bafetinib，INNO-406）是Bcr-Abl/Lyn雙激酶抑制劑。目前由CytRx Oncology公司進(jìn)行臨床II期研究，用于治療B細胞慢性淋巴細胞白血病，轉移性前列腺癌和惡性膠質(zhì)瘤。發(fā)明人Nippon Shinyaku亦研究了INNO-406在CML病人中的療效，19%的CML病人獲得主要血液學(xué)緩解，對加速期和急變期的病人無(wú)效。對多種突變有效，但對T315I突變無(wú)效。 

　　3.5 Rebastinib 

　　Rebastinib（DCC-2036，DP-1919.TO，Deciphera Pharmaceuticals LLC）是由Deciphera公司開(kāi)發(fā)的非ATP競爭型Bcr-Abl小分子抑制劑，作用于活化態(tài)以及非活化態(tài)的Bcr-Abl激酶的變構口袋，用于口服治療慢性粒細胞白血病和急性淋巴細胞白血病。在Ba/F3細胞增殖試驗中，Rebastinib能有效抑制野生型以及T315I突變型Bcr-Abl細胞，IC₅₀分別為5.8 nM和7.9 nM，而對正常Ba/F3細胞無(wú)顯著(zhù)影響。且每天服用Rebastinib能顯著(zhù)延長(cháng)Ba/F3 T315I感染的Balb/c小鼠的生存期，口服100mg/kg能抑制Abl和STAT5的磷酸化超過(guò)8小時(shí)。由于良好的生物活性以及安全性的支持，Rebastinib于2009年進(jìn)入臨床I/II期試驗。 

　　3.6 CR-4 

　　CR-4（LS-10）是酪氨酸激酶Jak2和Bcr-Abl的選擇性小分子抑制劑?；衔镌?/span>The Hospital for Sick Children發(fā)現，并由AEgera開(kāi)發(fā)。 CR-4不是ATP競爭性抑制劑，因此可能抑制由于ATP口袋突變導致的耐藥。但活性數據并未見(jiàn)報道。2008年，CR-4進(jìn)入臨床I期研究。