7月28日，克隆犬“龍龍”出生滿(mǎn)兩個(gè)月了?！褒堼垺币怀錾筒缓?jiǎn)單，因為它是中國首例完全自主培育的體細胞克隆犬，更是世界首例基因編輯克隆犬。該成果由生物院賴(lài)良學(xué)研究員帶領(lǐng)希諾谷公司科研團隊及廣州生物院實(shí)驗室團隊完成。6月底，公安部南昌警犬基地將“龍龍”的血液樣本，與另一只比格犬“蘋(píng)果”進(jìn)行DNA檢測發(fā)現，“龍龍”與“蘋(píng)果”同一認定幾率大于99.99%，但排除與代孕母犬親子關(guān)系。同時(shí)，中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院（簡(jiǎn)稱(chēng)生物院）賴(lài)良學(xué)研究員團隊，對“龍龍”與“蘋(píng)果”APOE基因進(jìn)行鑒定發(fā)現，其基因敲除方式也完全一致。

　　“蘋(píng)果”耳朵上被取下極小塊的皮膚組織

　　2016年底，世界首例動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型犬“蘋(píng)果”，在北京希諾谷公司誕生，它的名字源于A(yíng) POE基因的諧音。研究團隊的主要青年技術(shù)骨干王曉民介紹，“蘋(píng)果”出生后，研究人員從其耳朵上取下極小塊的皮膚組織，通過(guò)細胞體外培養，保存在液氮罐中，留待后續發(fā)力?！叭魏沃参锘騽?dòng)物的一個(gè)細胞，都包含了整個(gè)生物體的遺傳信息，哪怕只是極小塊的皮膚組織，通過(guò)細胞增殖后，都可以做無(wú)數次的實(shí)驗?！?/p>

　　摸清犬的發(fā)情排卵規律，團隊拿到了它的成熟卵母細胞，然后進(jìn)行克隆胚胎的構建。其過(guò)程是，先去掉卵母細胞的細胞核，“遺傳物質(zhì)都在細胞核中”，而后“蘋(píng)果”的體細胞從液氮中復蘇，經(jīng)電融合，將其細胞核轉入去核的卵母細胞，再激活重構的卵母細胞，克隆胚胎即構建完備。下一步就是把克隆胚胎移植到代孕的子宮，30天后，給狗做B超，檢測顯示，“代孕媽媽”懷孕了。又過(guò)一個(gè)月，2017年5月28日，世界首例基因敲除體細胞克隆犬“龍龍”誕生。

　　前后進(jìn)行了100多次實(shí)驗

　　最終攻克電融合等系列難題

　　犬不同于小鼠、牛、羊等生物，它很特殊，一直以來(lái)被認作是世界上最難被克隆的動(dòng)物之一。2005年，世界首例體細胞克隆犬“史努比”在韓國誕生。此后，犬體細胞克隆技術(shù)就一直掌握在韓國人手中，從未被其他國家突破?！褒堼垺钡恼Q生，也標志著(zhù)中國成為繼韓國之后第二個(gè)獨立自主掌握犬體細胞克隆技術(shù)的國家，同時(shí)，首次實(shí)現犬基因敲除體細胞克隆。

　　除了摸清發(fā)情規律，獲得成熟的卵母細胞外，最難的是電融合。犬卵母細胞中富含脂類(lèi)物質(zhì)，顏色較深，黏性很大，顯微操作較困難，電融合的效率不高，“團隊一直交流，不斷調整參數去試，最終才成功?！蓖鯐悦裾f(shuō)?！扒扒昂蠛蠊策M(jìn)行了100余次實(shí)驗?！蓖鯐悦裾f(shuō)，實(shí)驗最終攻克了電融合等一系列難題?！褒堼垺钡耐庥^(guān)跟“蘋(píng)果”看起來(lái)一樣，但因為“龍龍”還小，目前在動(dòng)脈粥樣硬化疾病上，尚沒(méi)有明確的表型。

　　科普

　　為何克隆犬此前鮮有聞之

　　21年前，克隆羊“多莉”誕生，震動(dòng)世界。而后，克隆牛、克隆豬等克隆動(dòng)物，陸續誕生，但對克隆犬，此前卻鮮有聞之？克隆犬的首要難題是成熟卵母細胞的獲取?？寺“ㄈ齻€(gè)主要的技術(shù)環(huán)節，一是成熟卵母細胞的獲取及卵母細胞去核，二是克隆胚胎制備，三是克隆胚胎的移植。

　　成熟卵母細胞的獲取有兩個(gè)途徑：體外成熟培養和體內輸卵管沖卵獲取。比如豬、牛、羊等動(dòng)物，可以去屠宰場(chǎng)獲取被屠宰牲畜的卵巢，從卵巢的卵泡中取出未成熟的卵母細胞，經(jīng)體外成熟培養后，便可用于后續的體細胞克隆。犬卵母細胞從卵泡中排出后處于G V期，是未成熟的卵子，需在輸卵管中停留48-72小時(shí)達到成熟期（MⅡ），而體外成熟培養效率極低，幾乎無(wú)法滿(mǎn)足克隆需求，因此只能通過(guò)體內成熟的方法，獲取體內成熟卵子，用于犬的體細胞克隆。

　　犬的發(fā)情周期長(cháng)達幾個(gè)月，發(fā)情期持續10-15天，但排卵后從卵母細胞成熟到老化的間隔時(shí)間較短。因此，獲取成熟且質(zhì)量好的卵母細胞窗口期非常短。這就要求準確判斷犬的排卵及卵子成熟的時(shí)間，才能獲得處于理想狀態(tài)的卵子用于克隆胚胎的制備。而一旦錯過(guò)卵子成熟的時(shí)間，下次排卵，就要等半年甚至一年。一只狗平均排卵7-8枚，“取得早沒(méi)成熟，過(guò)晚又老化了。甚至同一批卵母細胞，有的成熟早，有的晚?！?/p>

　　釋疑

　　克隆犬可以用來(lái)做什么？

　　王曉民說(shuō)，目前在韓國，克隆犬有多種用途，首先是克隆優(yōu)良工作犬，如搜救犬，緝毒犬，導盲犬等，“這些犬有些特殊的技能，跟遺傳因素影響比較大，而訓練起來(lái)又非常難?！睋蟮里@示，9·11事件中的“英雄”搜救犬，就曾被克隆出來(lái)?？寺∫灿脕?lái)保護瀕危犬科動(dòng)物，如紅狼，草原胡狼，灰狼等。建立疾病模型后，再“復制粘貼”，克隆技術(shù)還能夠制造更多的疾病模型犬，用于人類(lèi)疾病的研究。

　　此外，犬是非常理想和成熟的實(shí)驗動(dòng)物，與人類(lèi)在營(yíng)養代謝、生理解剖等方面有很多相似點(diǎn)，而且狗溫順，配合度高，“比豬、猴子等動(dòng)物都更聽(tīng)話(huà)?！辟?lài)良學(xué)說(shuō)，目前團隊在帕金森、自閉癥、糖尿病等方面都有研究，如果有需要，也可以建立狗疾病模型，進(jìn)行藥物篩選。王曉民說(shuō)，目前國內克隆動(dòng)物主要用于科學(xué)研究，包括疾病模型、藥物研發(fā)、瀕危物種保存等。賴(lài)良學(xué)說(shuō)，在“龍龍”出生后，不少警犬基地就打來(lái)電話(huà)，希望進(jìn)行合作。警犬珍貴，進(jìn)口又較貴，團隊后續也希望通過(guò)將基因編輯技術(shù)與克隆技術(shù)相結合，批量培育嗅覺(jué)、奔跑能力更強的警犬。

　　“復制版”寵物狗會(huì )保留原來(lái)的記憶嗎？

　　對愛(ài)養寵物的人來(lái)說(shuō)，最值得期待的就是克隆寵物犬了。有報道顯示，韓國有公司推出寵物克隆服務(wù)，每只克隆小狗的價(jià)值約為10萬(wàn)美元，價(jià)格不菲?！皠?dòng)物體細胞克隆研究相對較寬松，而人體細胞克隆研究是嚴格禁止的，包括早期體細胞克隆胚胎等?！蓖鯐悦裾f(shuō)。

　　克隆狗還留有原來(lái)的記憶嗎？性格愛(ài)好是否一致？王曉民說(shuō)，克隆犬從基因層面來(lái)說(shuō)，和它的原始版本并無(wú)二致，但它的成長(cháng)仍有后天因素的影響，性格、愛(ài)好、記憶，這些因素不可遺傳，被克隆狗的記憶只屬于自己，克隆狗也會(huì )有只屬于自己的記憶。王曉民查閱資料發(fā)現，韓國方面有對克隆狗的健康狀況做過(guò)研究，包括克隆狗的體重、體形、顱骨尺寸、骨板、血常規等的檢測，與正常狗相比沒(méi)有差別?？寺〉墓范己芙】?，沒(méi)有出現一些重大疾病，壽命與正常狗也相一致。

　　花絮

　　在增城一個(gè)狗場(chǎng)待一年

　　掌握狗狗排卵“寶典”

　　2012年因國家科技重大專(zhuān)項項目———“實(shí)驗用beagle犬及疾病模型犬研究開(kāi)發(fā)平臺”的需要，廣州醫藥研究總院有限公司聯(lián)合南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所及中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院共同從事犬疾病模型的研究。

　　從那時(shí)起，王曉民就成了狗場(chǎng)的“常駐民”。他待在廣州醫藥研究總院有限公司設立在增城的一個(gè)狗場(chǎng)，每天和成百上千只狗朝夕相處，觀(guān)察它們。彼時(shí)，他剛讀完研究生，對狗這種動(dòng)物的生殖生理特性并無(wú)太多了解。之所以要和狗相伴，是因為這個(gè)平臺最初的想法就是通過(guò)克隆的方法構建疾病模型犬。

　　在不確定性中找規律，是賴(lài)良學(xué)團隊首先要突破的。此時(shí)，團隊唯一的資源就是韓國人發(fā)表的文章，但因為沒(méi)有具體細節，一切都是從零開(kāi)始。王曉民記得，第一次做狗的“外科手術(shù)”，嘗試給狗取卵時(shí)，錯將子宮當成了輸卵管，還鬧了笑話(huà)。

　　實(shí)驗需要大量的樣本，狗的發(fā)情時(shí)間持續10-15天，王曉民從幾百只狗中，挑選處于同一發(fā)情階段的狗，聚集在一起，集中觀(guān)察，每天監控。他也嘗試用各種方法去記錄排卵時(shí)間。比如，通過(guò)血清測定孕激素判斷發(fā)情時(shí)間，但每只狗可能都不一樣，他嘗試搭配別的方法一起判定。在與狗狗相伴的一年時(shí)間里，王曉民終于掌握了一套自己的“寶典”，“測孕酮值、觀(guān)察細胞圖片、用公狗去試情，這三種方法配合使用?！?/p>

　　克隆狗誕生

　　“蘋(píng)果”出生后，從其耳朵上取下極小塊的皮膚組織，通過(guò)細胞體外培養，保存在液氮罐中。

　　摸清犬的發(fā)情排卵規律，團隊拿到它的成熟卵母細胞。

　　先去掉卵母細胞的細胞核，“遺傳物質(zhì)都在細胞核中”。

　　之后“蘋(píng)果”的體細胞從液氮中復蘇，經(jīng)電融合，將其細胞核轉入去核的卵母細胞。

　　再激活重構的卵母細胞，克隆胚胎即構建完備。

　　把克隆胚胎移植到代孕的子宮。

　　30天后，給狗做B超，檢測顯示，“代孕媽媽”懷孕了。

　　又過(guò)一個(gè)月，“龍龍”就降生了，克隆狗由此誕生。

　　出品：南方都市報科學(xué)新聞工作室 主持：陳養凱

　　采寫(xiě)：南都記者陽(yáng)廣霞 實(shí)習生侯雅欣 通訊員黃博純