iPS克隆豬

研究團隊成員合影

　　本報記者　張建列　通訊員　黃博純

　　世界上首次獲得了iPS克隆豬，為基于iPS進(jìn)行基因修飾大動(dòng)物的制作打通了技術(shù)路線(xiàn)；首次將鋅指核酸酶介導的基因打靶技術(shù)應用于豬基因修飾，使豬體細胞打靶效率由10-6提高到4%，實(shí)現了對大動(dòng)物高效基因打靶；首次將2A序列介導的多基因轉移技術(shù)應用于豬基因組修飾，成功獲得了四色熒光豬，并實(shí)現了多個(gè)外源基因在動(dòng)物體內的高效協(xié)同表達……這些原創(chuàng )成果出自中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院聯(lián)合南方醫科大學(xué)、浙江大學(xué)、深圳華大基因研究院等完成的項目《豬基因突變技術(shù)創(chuàng )新及基因修飾豬模型的建立》，該項目組在大動(dòng)物基因修飾技術(shù)方面所取得的突破及所獲得的動(dòng)物模型，將進(jìn)一步促進(jìn)基因修飾大動(dòng)物作為生物醫藥模型的研究，推動(dòng)生物醫藥業(yè)的發(fā)展，并由此獲2015年度廣東省科學(xué)技術(shù)獎一等獎。

　　豬是更理想的人類(lèi)疾病模型

　　人類(lèi)疾病動(dòng)物模型作為人類(lèi)疾病的“復制品”，可按研究者的需要隨時(shí)采集各種樣品或分批處死動(dòng)物收集標本，以了解疾病全過(guò)程，這是臨床難以辦到的。項目的第二完成人、中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院副研究員樊娜娜介紹，人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型是指各種醫學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類(lèi)疾病模擬表現的動(dòng)物，包括小鼠、豬、狗等，主要用于實(shí)驗生理學(xué)、實(shí)驗病理學(xué)和實(shí)驗治療學(xué)（包括新藥篩選）研究?！芭c人類(lèi)完全相同的動(dòng)物自發(fā)性疾病模型畢竟不可多得，往往需要人工加以復制。為了盡量做到與人類(lèi)疾病相似，首先要注意動(dòng)物的選擇?！?/p>

　　從基因角度上看，豬與人類(lèi)基因的相似性達到83%，因此豬在醫學(xué)研究上有很大前景。樊娜娜說(shuō)，小鼠與人在心血管系統、神經(jīng)系統、營(yíng)養代謝等方面與人體差異較大，用做人類(lèi)疾病模型時(shí)不能準確反映人類(lèi)疾??；小鼠體型小、壽命短不適合進(jìn)行一些治療技術(shù)開(kāi)發(fā)和長(cháng)效研究?！氨热?，因為豬與人類(lèi)生理比較接近，我們可以讓豬得人類(lèi)的疾病，進(jìn)而探討治療方法，這比將小鼠作為模型動(dòng)物要可靠得多。

　　“小鼠研究模型有很多種，也很成熟，但和人的差異比較大，不能完全反映人的情況。炎癥反應小鼠和人是不同的，前幾年美國曾經(jīng)上市一種治療糖尿病的藥品，在小鼠實(shí)驗的效果非常理想，然而用到人身上卻副作用非常大，最終這個(gè)藥被撤了?，F在美國FDA審批藥物上臨床治療時(shí)，要求有大動(dòng)物模型實(shí)驗后，才能用到人上?！?/p>

　　獲得世界首例iPS克隆豬

　　豬的生理特征、器官組織結構和人類(lèi)比較類(lèi)似，特別是豬的肝臟、心臟等器官與人類(lèi)的相似性也很高，科學(xué)家們一直在尋找將豬作為人源化器官培養體的方式。樊娜娜說(shuō)，這一切都需要制備基因修飾豬。自2007年起，在項目的第一完成人、中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院研究員賴(lài)良學(xué)的帶領(lǐng)下，項目組聚焦大動(dòng)物基因修飾技術(shù)研究及基因修飾動(dòng)物模型的建立工作。

　　樊娜娜介紹：“目前來(lái)說(shuō)轉基因豬制備包括隨機轉基因和基因打靶兩種方式，其中：隨機轉基因豬是把外源基因放到豬里面，讓豬表達它自己沒(méi)有的基因；基因打靶是把某個(gè)基因放到豬基因的特定位置，想對豬的哪個(gè)基因進(jìn)行突變或修飾都可以?；虼虬邪▋煞N功能：一是基因敲除，即把某個(gè)基因去掉，二是基因敲入，是把某個(gè)基因放到基因組的某一個(gè)地方?！?/p>

　　但是，由于缺乏豬胚胎干細胞，轉基因豬的制備主要依賴(lài)于體細胞基因修飾和體細胞核移植技術(shù)。這種技術(shù)用來(lái)進(jìn)行隨機轉基因豬的制作無(wú)壓力，但是由于體細胞打靶效率極低，對豬進(jìn)行基因定點(diǎn)修飾非常困難。這成了研究中最大的瓶頸。各國科學(xué)家都希望通過(guò)豬的iPS（誘導多能干細胞，induced pluripotent stem cells）來(lái)克隆豬，但未能獲成功?！癷PS的出現為大動(dòng)物基因打靶提供了新的希望。獲得基因打靶的iPS細胞之后，一方面可以通過(guò)嵌合體技術(shù)，獲得生殖系嵌合的動(dòng)物，經(jīng)過(guò)交配獲得基因修飾動(dòng)物；另一方面，可將這些基因打靶iPS細胞為核供體，通過(guò)核移植技術(shù)獲得基因修飾克隆動(dòng)物?！?/p>

　　在不懈努力下，項目組發(fā)現外源基因的表達和表觀(guān)遺傳學(xué)可能是影響iPS克隆胚胎發(fā)育的主要原因，經(jīng)過(guò)反復的實(shí)驗，項目組在2011年獲得世界上第一個(gè)成活的iPS克隆豬。iPS來(lái)源克隆豬的成功，為基于iPS 進(jìn)行基因修飾豬的制作打通了技術(shù)路線(xiàn)?？朔艘泽w細胞進(jìn)行基因修飾存在的體外增殖能力有限，打靶效率低的難題。

　　大動(dòng)物領(lǐng)域，基因打靶技術(shù)國際領(lǐng)先

　　如何提升豬的打靶效率？樊娜娜表示，“以前大動(dòng)物上沒(méi)有胚胎干細胞（ES），體細胞打靶效率極低，在小鼠上能做的東西大動(dòng)物上做不到，或者說(shuō)能做但很難做，所以我們做不過(guò)嚙齒類(lèi)動(dòng)物。但是近十年，隨著(zhù)鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)、TALENs基因敲除技術(shù)、CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)等興起，這幾種新的基因打靶技術(shù)的出現使大動(dòng)物的基因定向修飾變得非常容易，通過(guò)這幾種技術(shù)現在我們可以在大動(dòng)物上實(shí)現基因打靶了?！?/p>

　　2008年，鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，“當時(shí)我們項目組立即跟進(jìn)，將該技術(shù)應用于豬胎兒成纖維細胞進(jìn)行基因打靶，使體細胞打靶效率由10-6 提高到4%；確立了以鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)對胎兒成纖維進(jìn)行打靶后再進(jìn)行核移植的高效基因打靶豬制作技術(shù)路線(xiàn)。樊娜娜坦言，獲獎項目只是針對鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)的應用，但是項目組一直沒(méi)有停步，一直緊跟基因打靶技術(shù)的前沿，在TALENs基因敲除技術(shù)和CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)等當前先進(jìn)基因修飾技術(shù)在大動(dòng)物基因修飾應用領(lǐng)域，項目組也處于國際的領(lǐng)先水平。

　　“目前來(lái)說(shuō)，國內外在轉基因、基因打靶方面技術(shù)基本上與國際是同步的，但這些技術(shù)都不是我們國內科學(xué)家發(fā)現的，而把這些技術(shù)應用到大動(dòng)物領(lǐng)域并取得重大研究成果我們是占據了領(lǐng)先位置?！?/p>

　　促進(jìn)豬模型在生物醫藥的應用研究

　　據悉，通過(guò)實(shí)施該項目，項目組在Cell Research、Human Molecular Genetics等雜志上發(fā)表論文5篇，其中發(fā)表在Human Molecular Genetics的論文被選為封面文章刊出。論文被SCI數據庫論文總引用149次，他引115次，單篇最高引用49次，他引42次。項目在大動(dòng)物基因修飾技術(shù)方面所取得的突破及所獲得的動(dòng)物模型將進(jìn)一步促進(jìn)基因修飾大動(dòng)物作為生物醫藥模型的研究，推動(dòng)生物醫藥業(yè)的發(fā)展，具有巨大的社會(huì )效益和經(jīng)濟效益。

　　“目前，我們建立了多種人類(lèi)疾病模型豬、器官移植模型豬、基礎研究工具豬模型等。其中，我們建立的人類(lèi)亨廷頓疾病模型豬表現出與人類(lèi)亨廷頓舞蹈癥患者腦中類(lèi)似的神經(jīng)細胞凋亡現象，這在亨廷頓疾病模型中是首次見(jiàn)到?！狈饶冉馕稣f(shuō)，亨廷頓疾病是遺傳性神經(jīng)退行性疾病，影響肌肉的協(xié)調性，導致認知功能減退和精神問(wèn)題。豬的大腦結構與人更為接近，適合用于人退行性神經(jīng)疾病的研究?！昂嗤㈩D疾病模型豬已列入亨廷頓疾病協(xié)作組，對全世界亨廷頓疾病研究團隊開(kāi)放使用，以促進(jìn)亨廷頓疾病治療研究，《豬基因突變技術(shù)創(chuàng )新及基因修飾豬模型的建立》項目的完成推動(dòng)了我國大動(dòng)物模型研究工作，促進(jìn)了豬這一大動(dòng)物模型在生物醫藥領(lǐng)域的應用研究?！?/p>

　　樊娜娜也坦言，這些人類(lèi)疾病模型豬還處于發(fā)展的初期。目前，這些模型做出來(lái)了但是還沒(méi)有得到大規模的應用，這里有多方面的原因：一是沒(méi)有相應的高標準的飼養條件，如無(wú)病原飼養室，如免疫缺陷型模型豬對病源無(wú)抵抗力，在普通飼養環(huán)境中不能長(cháng)期存活；另外，對豬行為學(xué)、影像學(xué)的研究缺少完善的評價(jià)體系，導致很多模型無(wú)法廣泛應用，這些評價(jià)標準還需要實(shí)驗動(dòng)物行為學(xué)的專(zhuān)業(yè)人員參與制定。

　　基因修飾豬應用未來(lái)大有前途

　　豬作為重要的經(jīng)濟動(dòng)物是人類(lèi)生活關(guān)系最為密切的家畜之一，轉基因豬在農業(yè)領(lǐng)域中應用廣泛?？梢詫ωi的基因進(jìn)行改造，提高豬肉產(chǎn)量，改善豬肉的質(zhì)量，增加豬肉的營(yíng)養價(jià)值等，也可以提高豬的抗病能力。樊娜娜還舉了一個(gè)例子，比如糖尿病人，是不能吃糖的?！暗强梢詫⒁环N糖味蛋白基因轉到牛身上，讓這個(gè)基因在乳腺中表達，那么這種牛產(chǎn)出的奶就是有甜味。這種牛奶的甜味不是來(lái)自糖而是來(lái)自蛋白，這樣糖尿病人就可以吃到有甜味的牛奶了?！?/p>

　　豬在解剖、組織、生理和營(yíng)養代謝等方面均與人類(lèi)最接近，在生物醫藥方面，可以進(jìn)行異種器官移植，即把豬的器官移植到人身上，比如把豬的腎臟、心臟、胰臟、角膜等往人身上移。在此之前，賴(lài)良學(xué)研究員及其合作者曾經(jīng)將超級性排斥相關(guān)基因敲除后的豬心臟移植到狒狒身上，并成功最終存活了6個(gè)月左右。樊娜娜說(shuō)，豬器官移植到人體，阻礙異種器官移植工作獲得成功的首要問(wèn)題是免疫學(xué)上的排異反應問(wèn)題，再就是豬的內源性病毒?！柏i的內源性病毒是整合在豬的基因組內的，對豬是沒(méi)有影響，但是豬器官移植到人體，病毒可能會(huì )被激活，讓人感染得病。目前我們項目組正在把這些病毒基因敲掉?！?/p>

　　目前干細胞技術(shù)發(fā)展很快，更大膽的展望是人源化器官的實(shí)現，“讓豬體內長(cháng)出人的器官?！狈饶冉忉屨f(shuō)，將來(lái)把人的干細胞放到器官缺陷豬的早期胚胎中，這樣豬就可以長(cháng)出人的器官，這就是人源化器官，在此之前有日本科學(xué)家在小鼠身上長(cháng)出大鼠的胰臟，說(shuō)明人源化器官的預想是可實(shí)現的，這也是未來(lái)大有前途的研究領(lǐng)域。在賴(lài)良學(xué)研究員的帶領(lǐng)下，項目組目前已經(jīng)在開(kāi)展人源化器官的研究工作。

　　來(lái)源：《廣東科技報》4月22日特別報道