基因單核苷酸變異（SNV）與基因功能密切相關(guān)?；谌諠u普及的高通量測序技術(shù)，研究人員在動(dòng)植物乃至人類(lèi)基因組中發(fā)現了大量的SNVs。這些細微的基因差異中的部分已經(jīng)被證實(shí)與動(dòng)植物的性狀變異相關(guān)，也與人類(lèi)遺傳疾病的發(fā)生發(fā)展或藥物療效存在密切聯(lián)系。但是目前仍有大量SNV的功能尚未得到明確，如何揭示這些遺傳變異與物種性狀及臨床表型間的關(guān)聯(lián)，是農業(yè)分子育種和精準醫學(xué)研究等領(lǐng)域向前推進(jìn)時(shí)亟需解決的瓶頸。 

　　基因飽和突變文庫是研究基因SNV功能的重要工具。利用基因編輯技術(shù)在基因特定區域中引入不同類(lèi)型的堿基突變，并以其為基礎進(jìn)行功能性篩選，可以實(shí)現基因SNV功能的高通量研究。 

　　近年來(lái)，基因突變文庫構建主要借助CRISPR/Cas9系統在目標區域內引入移碼突變破壞基因表達，從而根據表型鑒定基因功能。這種方式也可以誘導基因SNV的產(chǎn)生，但是效率極其低下，不適合用于與基因SNVs相關(guān)的飽和突變文庫的高效構建。David Liu實(shí)驗室開(kāi)發(fā)的堿基編輯器（BE）為飽和文庫的構建帶來(lái)了技術(shù)上的突破。BE系統可以在基因特定區域引入高效的單堿基轉換，因此被迅速應用于與DNA損傷應答或癌癥相關(guān)的基因SNVs功能的高通量篩選等研究中，并取得了突破性的成果。但現有的BE只能實(shí)現一種或兩種類(lèi)型的堿基轉換，不能滿(mǎn)足飽和突變文庫對編輯產(chǎn)物多樣性的需求，因此，亟需建立可以誘導多種類(lèi)型堿基轉換的基因編輯工具。 

　　該研究將腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和糖苷酶堿基編輯器（CGBE）結合，開(kāi)發(fā)出一種新型的雙堿基編輯器——AGBE。它可以利用單個(gè)向導RNA（sgRNA）誘導同一等位基因的靶序列單獨或同時(shí)發(fā)生包括A-to-G、C-to-G、C-to-T和C-to-A等4種不同類(lèi)型的堿基轉換。隨后，研究人員在永生化細胞系、原代細胞和胚胎細胞等多個(gè)哺乳動(dòng)物的細胞體系中驗證了AGBE系統的有效性。結果表明，與單獨的ABE和CGBE相比，AGBE極大地拓寬編輯窗口（從4-8到3-13），在此基礎上通過(guò)將不同類(lèi)型的堿基轉換進(jìn)行組合，可以大幅度地增加編輯產(chǎn)物的多樣性，從而構建出含有更多基因突變類(lèi)型的突變文庫。令人驚喜的是，研究人員通過(guò)分析全基因組和轉錄組測序數據，發(fā)現AGBE并不會(huì )引起明顯的DNA或RNA水平的脫靶效應，證明了該系統是一款高效且安全的堿基編輯工具。 

　　研究人員挑選了人類(lèi)白喉毒素受體基因hDTR用于驗證AGBE在基因飽和突變文庫構建中的應用潛能。當hDTR基因發(fā)生突變時(shí)，會(huì )改變人類(lèi)細胞對白喉毒素的敏感性，結合白喉毒素篩選和富集，可以快速獲得具有白喉毒素抗性的突變文庫，從而分析hDTR基因的SNV與藥物敏感性間的聯(lián)系。研究結果表明，在針對hDTR基因的關(guān)鍵功能域設計的32條sgRNA中，有20條可以賦予細胞抵抗白喉毒素的能力，產(chǎn)生了多達59269種不同類(lèi)型的等位基因突變產(chǎn)物，并從中篩選出對白喉毒素有不同敏感性的突變細胞株。以上結果充分證實(shí)了利用AGBE系統進(jìn)行基因SNVs功能高通量研究的可行性和高效性。 

　　本研究中，中國科學(xué)院廣州生物醫藥與健康研究院賴(lài)良學(xué)課題組梁艷慧博士、謝精科博士、張全軍助理研究員和王曉民博士為共同第一作者，賴(lài)良學(xué)研究員和王可品副研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、廣東省科技計劃、中國科學(xué)院青年創(chuàng )新促進(jìn)會(huì )和中國科協(xié)青年人才托舉工程等項目的資助。

　　論文鏈接

　　新型雙堿基編輯器AGBE工作原理圖